RNA提取準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)有什么？

你知道RNA提取準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)都有什么嗎？讓我們一起來看看吧！

一、槍頭和EP管等的消毒滅菌

1. 用去離子水配制0.1%（千分之一）的DEPC（劇毒物），須在通風(fēng)櫥中小心使用，避光密閉4℃保存;

DEPC水是用DEPC處理過并經(jīng)高溫高壓消毒的純水。經(jīng)檢測不含RNase、DNase和proteinase。

2. 將槍頭和EP管放入0.1%的DEPC內(nèi)，保證槍頭和EP管內(nèi)都充滿0.1%的DEP。

3. 避光、靜置、過夜（12-24h）

4. 裝槍頭和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，將槍頭或者EP管內(nèi)的DEPC水大致去除干后，裝起，包好

5. 121攝氏度，30min

6. 180攝氏度，干燥數(shù)個(gè)鐘頭（至少3小時(shí)以上）

注意：a、處理DEPC時(shí)需要戴乳膠手套、口罩！b、或者不用DEPC消毒，130℃，90min高壓滅菌（許多實(shí)驗(yàn)室高溫滅菌兩次）

RNA提取注意事項(xiàng)

二、組織 RNA 抽提失敗的現(xiàn)象

RNA降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留，關(guān)于降解問題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提RNA不容易降解。現(xiàn)有的RNA抽提試劑，都含有快速抑制Rnase的成分。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細(xì)胞與裂解液充分混勻，細(xì)胞被徹di裂解。細(xì)胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細(xì)胞內(nèi)的Rnase，所以RNA得以保持完整。也就是說，培養(yǎng)細(xì)胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其RNA不容易被降解；反過來講，組織中的RNA之所以容易被降解，是因?yàn)榻M織中的細(xì)胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制RNA活性的同時(shí)能使組織變成單個(gè)細(xì)胞，降解問題也就可以徹di解決了。

液氮碾磨就是zui有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時(shí)候更加會(huì)有此感覺。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考慮細(xì)胞與裂解液接觸前如何抑制Rnase活性這個(gè)問題，而是祈禱破碎組織的速度比細(xì)胞內(nèi)的Rnase降解RN 的速度快

電動(dòng)勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來用電動(dòng)勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動(dòng)勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎 100% 能獲得解決。

三、樣品的收集/保存

影響降解的因素樣品離開活體/或者原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會(huì)開始降解 RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個(gè)辦法可以徹di抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹di而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個(gè)辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。

四、裂解液的選擇

影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素常用的裂解液幾乎都能抑制Rnase活性，因此，選擇裂解液的重點(diǎn)是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有一個(gè)例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。

五、純化方法的選擇

影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素對(duì)于干凈的樣品，如細(xì)胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對(duì)于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價(jià)格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如LiCl沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時(shí)間長。

六、RNase污染的來源

1. 手指，手指頭是外源酶的第一來源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因?yàn)楹粑彩且粋€(gè)重要的酶來源。戴手套口罩的另外的好處是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。

2. 槍頭，離心管，移液器 – 單純的滅菌是不能滅活Rnase的，所以槍頭和離心管要用DEPC處理，即使是標(biāo)明為DEPC處理過的。移液器最好是專用的，用前用75%的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。

3. 水/緩沖液一定要確保無Rnase污染。

4. 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面最起碼要用75%的酒精棉球搽拭干凈。

5. 內(nèi)源Rnase所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對(duì)有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯yi的辦法。

6. RNA樣品RNA抽提產(chǎn)物可能都會(huì)含痕量的Rnase污染。

7. 質(zhì)粒抽提質(zhì)粒抽提往往用到Rnase降解RNA，殘留的Rnase要用 Proteinase K消化，PCI 抽提。

8. RNA保存即使低溫保存，痕量的Rnase亦會(huì)導(dǎo)致RNA降解。長期保存RNA 的最好辦法是鹽/醇懸液，因?yàn)榇荚诘蜏貢r(shí)抑制所有的酶活性。

9. 陽離子（Ca、Mg）在含這些離子時(shí)，80C加熱5分鐘會(huì)導(dǎo)致RNA被剪切，故如果RNA需要被加熱，保存液需要含螯合劑（1mM Sodium Citrate， pH 6.4）。

10. 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶酶均有可能被Rnase污染。

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